基于PacBio三代測序平臺的全長轉錄組測序(Iso-Seq),可直接獲得mRNA的全長序列,可更為準確地解讀mRNA的結構信息。通過全長轉錄組測序,可克服無參考基因組物種轉錄本拼接短、信息不完整的難題,獲取全長mRNA序列,實現同源異構體分析,單堿基變異檢測,可變剪接分析,同源基因識別及等位基因識別。

方案設計

全長轉錄組實驗設計思路可以是單個樣品進行測序,與參考基因組進行比較進行結構分析,亦可以對多個樣品進行基因結構方面的差異比較分析。

技術路線

技術路線

分析內容

    1.     RoI序列統計
    2.     RoI序列長度分布
    3.     RoI序列質量分布
    4.     RoI Number of Passes分布
    5.     轉錄本分類
    6.     聚類與校正
    7.     比對及進一步聚類
    8.     Known Isoforms注釋匯總
    9.     Known Isoforms Go注釋統計
    10.     Known Isoforms KEGG注釋統計
    11.     Known Isoforms eggNOG注釋統計
    12.     Novel Isoforms注釋匯總
    13.     Novel Isoforms NR注釋統計
    14.     Novel Isoforms GO注釋統計
    15.     Novel Isoforms KEGG注釋統計
    16.     Discarded Isoforms eggNOG注釋統計
    17.     Discarded Isoforms注釋匯總
    18.     Discarded Isoforms NR注釋統計
    19.     Discarded Isoforms GO注釋統計
    20.     Discarded Isoforms KEGG注釋統計
    21.     Discarded Isoforms eggNOG注釋統計
    22.     融合基因分析
    23.     基因結構優化
    24.     SNP分析
    25.     可變剪切分析
    26.     基因表達量統計(結合二代測序數據)
    27.     基因表達差異分析(結合二代測序數據)
    28.     表達差異基因GO富集分析(結合二代測序數據)
    29.     表達差異基因KEGG通路富集分析(結合二代測序數據)
    30.     表達差異基因聚類分析(結合二代測序數據)

部分分析結果展示
Pacbio Iso-Seq

基于Pacbio Iso-Seq的轉錄本表征

jiyinranseti
差異基因染色體分布

案例解析

蓮草直胸跳甲全長轉錄組分析
本研究對空心蓮子草進行了全長轉錄組測序,獲得較完整的轉錄本集合,預測了145個可變剪接事件;27318條簡單重復序列,經TransDecoder鑒定獲得24,040個ORF,其中有16,205個完整的ORF;預測得到4,198 個lncRNA,為進一步研究蓮草直胸跳甲與宿主植物和生態系統之間相互作用的分子機制提供了很好的遺傳信息基礎。

gogongneng

蓮草直胸跳甲轉錄本的GO功能注釋


參考文獻:
Jia D, Wang Y, et al. SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt). Scientific reports, 2018.

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